本報(bào)記者 張 曄 新冠肺炎疫情發(fā)生以來,關(guān)于核酸檢測假陰性率過高的話題,一直是各方關(guān)注的焦點(diǎn)。有報(bào)道稱,以熒光定量RT-PCR作為檢測手段的新冠病毒檢測的陽性率目前僅有30%—50%,導(dǎo)致奇高的假陰性率。 導(dǎo)致假陰性率發(fā)生的原因很多。2月22日,南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所發(fā)育生物學(xué)與遺傳學(xué)教授趙慶順接受科技日?qǐng)?bào)記者獨(dú)家采訪時(shí)指出,依據(jù)有關(guān)機(jī)構(gòu)發(fā)布的指南,核酸檢測前需將采集到的樣品進(jìn)行56℃滅活,這極有可能使新冠病毒核酸被降解,從而導(dǎo)致不能被正常檢出,最終提高了假陰性率。該研究成果《病毒核酸提取前的高溫滅活過程顯著降低可檢出病毒核酸模板量》,已在中國科學(xué)院科技論文平臺(tái)預(yù)發(fā)布。 56℃滅活可能導(dǎo)致病毒核酸被降解 2019新型冠狀病毒的遺傳物質(zhì)是單鏈RNA。因此,科研人員的目標(biāo)是在患者身上找到新冠病毒的RNA。這也是臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)。 目前,臨床檢測主要采用熒光定量RT-PCR試劑盒檢測。該方法是將標(biāo)本中的特定RNA序列逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)過30次以上擴(kuò)增后,病毒基因片段達(dá)到一定數(shù)量即可進(jìn)行可視檢測。 “理論上,哪怕模板只有1個(gè)病毒,就有可能被檢測出來。”趙慶順說,科研實(shí)踐中,在模板(病毒)量大于100個(gè)的情況下,擴(kuò)增結(jié)果就會(huì)非常穩(wěn)定。 但是,趙慶順在網(wǎng)絡(luò)上看到一個(gè)教學(xué)視頻,不禁心生疑慮。該視頻由北京協(xié)和醫(yī)院和北京市衛(wèi)健委聯(lián)合制作。視頻3分08秒至3分40秒顯示:在制備核酸模板前,需將采集到的樣品在56℃條件下進(jìn)行30分鐘病毒滅活。 記者在中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)發(fā)布的《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實(shí)驗(yàn)室檢測的生物安全防護(hù)指南(試行第一版)》中也看到:核酸擴(kuò)增前,可以對(duì)標(biāo)本先行消毒。包括56℃孵育30分鐘,加蛋白酶K。 中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識(shí)》中,明確指出需將樣品56℃孵育至少45分鐘或更高溫度進(jìn)行滅活。 記者通過采訪確認(rèn),絕大多數(shù)檢驗(yàn)醫(yī)師均按照上述規(guī)范,進(jìn)行56℃條件下時(shí)間不等的病毒滅活,然后才制備核酸模板。 這樣做帶來的問題是,病毒RNA極易被核糖核酸酶降解,因?yàn)檫@種酶在60℃時(shí)活性最高。核糖核酸酶來自兩方面,一是樣本細(xì)胞內(nèi),二是采集、保存、運(yùn)輸過程中的外來污染物。 進(jìn)行滅活處理是出于生物安全的考慮 “進(jìn)行滅活處理是出于生物安全的考慮,保護(hù)從事檢測的工作人員不被病毒感染?!壁w慶順說。 正是出于這方面的考慮,國家衛(wèi)健委發(fā)布的相關(guān)文件中,明確要求對(duì)標(biāo)本進(jìn)行滅活處理。 北京協(xié)和醫(yī)院制作的教學(xué)視頻以及中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)發(fā)布的《防護(hù)指南》和《專家共識(shí)》,依據(jù)正是來自國家衛(wèi)健委相關(guān)文件,包括《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南(第二版)》《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南(第三版)》等。 但是,記者查詢了國家衛(wèi)健委相關(guān)文件,其對(duì)于病毒滅活的具體方法并未做出明確規(guī)定,只是籠統(tǒng)地要求:感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進(jìn)行的核酸檢測。 趙慶順進(jìn)一步查閱了美國疾控中心、香港大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院以及華大基因發(fā)布的核酸檢測說明,也未發(fā)現(xiàn)56℃滅活這一步驟。 病毒核酸降解對(duì)檢測結(jié)果影響究竟有多大 記者在采訪中發(fā)現(xiàn),不同人士對(duì)這個(gè)問題的回答涇渭分明: 來自疾控部門、中國醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)、相關(guān)醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)師的看法是,不會(huì)對(duì)檢測結(jié)果有太大的影響。而趙慶順等專家認(rèn)為,核酸提取前對(duì)人體樣品進(jìn)行高溫殺毒處理,可能是導(dǎo)致新冠病毒核酸檢出假陰性率過高的重要原因之一。 趙慶順以豬流行性腹瀉病毒(一種冠狀病毒,來自活疫苗)為模型開展了高溫滅活對(duì)病毒可檢出量影響的研究,結(jié)果表明:保存在普通等滲溶液(Hank’s液)中的樣品經(jīng)56℃孵育30分鐘,導(dǎo)致樣品中可檢出的冠狀病毒模板減少一半,如果以92℃孵育5分鐘,則可檢出的冠狀病毒模板損失96%以上。 “理論上,不排除新冠病毒的目標(biāo)RNA片段在56℃以上高溫滅活中不易被降解的可能?!壁w慶順坦言,“但我寧愿自己的判斷是錯(cuò)的,也不希望因?yàn)槟硞€(gè)細(xì)節(jié)考慮不周而導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。” 另外,不同品牌的樣品保存液,也會(huì)對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生較大影響。趙慶順在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在56℃30分鐘條件下,采用南京諾唯贊研發(fā)的R503保存液存放豬流行性腹瀉病毒樣品時(shí),病毒核酸的可檢出量是對(duì)照組(Hank’s液)檢出量的3倍;而如果是92℃5分鐘滅活,則檢出量是對(duì)照組的42倍。 中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)主任委員王成彬教授在撰文回應(yīng)核酸檢測假陰性率較高現(xiàn)象時(shí)也指出,不同提取試劑對(duì)最后提取到的核酸數(shù)量和質(zhì)量可能存在差別,從而直接影響檢測結(jié)果。他建議,對(duì)于某些高度疑似病例,或檢測結(jié)果難以確定的病例,建議用2種以上試劑進(jìn)行檢測、驗(yàn)證。 “假陰性意味著漏檢,不僅會(huì)導(dǎo)致臨床中對(duì)疑似患者不能快速確診,而且會(huì)使漏檢者成為潛在的病毒傳染源?!壁w慶順為此提出建議,一是盡量使用無核糖核酸酶污染的樣本采集管,二是將標(biāo)本放置在可保護(hù)病毒核酸免受高溫滅活損壞的樣品保存液中,從而確保樣品RNA從保存、運(yùn)輸?shù)礁邷販缁畹鹊玫饺瘫Wo(hù),盡最大可能保證用于臨床檢測的核酸質(zhì)量,減少病毒核酸可檢出模板在核酸提取前的人為損壞。 |
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